In relazione all'articolo sulla mutazione genetica del recettore dell'acetilcolina nella SLA sporadica

di Sabatelli et alii,

pubblicato dalla Human Molecular Genetics,

di seguito si riporta l'abstract dell'articolo e una nota esplicativa del dr. Mario Sabatelli riguardante i risultati della ricerca.

Human Molecular Genetics Advance Access

published online on July 23, 2009

Rare Missense Variants of Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor Altering Receptor Function Are Associated with Sporadic Amyotrophic Lateral SclerosisMario Sabatelli (1,2,*), Fabrizio Eusebi (3,4), Ammar Al-Chalabi (5), Amelia Conte (1,2), Francesca Madia (1), Marco Luigetti (1), Irene Mancuso (2,5), Cristina Limatola (3,4), Flavia Trettel (3), Fabrizia Sobrero (3), Silvia Di Angelantonio (6), Francesca Grassi (3), Amalia Di Castro (3), Claudia Moriconi (3), Sergio Fucile (3,4), Serena Lattante (7), Giuseppe Marangi (7), Marina Murdolo (7), Daniela Orteschi (7), Alessandra Del Grande (1), Pietro Tonali (1,8), Giovanni Neri (7) and Marcella Zollino (7)1 Istituto di Neurologia. Università Cattolica del Sacro Cuore. Roma. Italy 2 I.CO.M.M. Association for ALS research. Rome 3 Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia-Centro di Eccellenza BEMM, Sapienza Università di Roma. Italy 4 Neuromed I.R.C.C.S., Isernia. Italy 5 MRC Centre for Neurodegeneration Research, King's College London Institute of Psychiatry, London, UK 6 Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo – CRIN, Sapienza Università di Roma, Italy 7 Istituto di Genetica Medica. Università Cattolica del Sacro Cuore. Roma. Italy 8 Fondazione Don C. Gnocchi I.R.C.C.S. Roma. Italy.*

Correspondng author: Mario Sabatelli e-mail: msabatelli@rm.unicatt.it Telephone number: +39-06-30154303; Fax number: +39-06-35501909

Sporadic amyotrophic lateral sclerosis (SALS) is a motor neuron degenerative disease of unknown aetiology. Current thinking on SALS is that multiple genetic and environmental factors contribute to disease liability. Since neuronal AChRs are part of the glutamatergic pathway, we searched for sequence variants in CHRNA3, CHRNA4 and CHRNB4 genes, encoding neuronal nicotinic acetylcholine receptor (AChR) subunits, in 245 SALS patients and in 450 controls. We characterized missense variants by in vitro mutagenesis, cell transfection and electrophysiology.Sequencing the regions encoding the intracellular loop of AChRs subunits disclosed 15 missense variants (6.1%) in 14 patients compared with only 6 variants (1.3%) in controls (p=0.001; OR 4.48, 95% CI 1.7 to 11.8). The frequency of variants in exons encoding extracellular and transmembrane domains and in intronic regions did not differ. NAChRs formed by mutant 3 and 4 and wild type (WT) β4 subunits exhibited altered affinity for nicotine (Nic), reduced use-dependent rundown of Nic-activated currents (INic) and reduced desensitization leading to sustained intracellular Ca2+ concentration, in comparison to WT-nAChR.The cellular loop has a crucial importance for receptor traffiking and regulating ion channel properties. Missense variants in this domain are significantly over-represented in SALS patients and alter functional properties of nAChR in vitro, resulting in increased Ca2+ entry into the cells. We suggest that these gain-of-function variants might contribute to disease liability in a subset of SALS because Ca2+ signals mediate nAChR's neuromodulatory effects, including regulation of glutamate release and control of cell survival.
Nota esplicativa del dr. Mario Sabatelli PremessaL’ipotesi attualmente più accreditata è che la SLA sporadica sia una malattia genetica “complessa”.

Nelle malattie genetiche “semplici” l’alterazione di un singolo gene è di per sé sufficiente a provocare un danno grave alla cellula, per cui chi è portatore di una mutazione ha altissime probabilità di sviluppare la malattia che di conseguenza diventa ereditabile.

Nelle malattie genetiche complesse, come la SLA, la demenza, l’ipertensione, il diabete, si pensa che la causa sia ugualmente genetica, ma in questi casi l’alterazione del DNA induce un danno lieve che da solo non produce malattia.

Questo tipo di alterazione genetica può pertanto essere individuato anche nelle persone sane.

La malattia si sviluppa solo se partecipano altri fattori, per esempio di tipo ambientale, responsabili anch’essi di un danno lieve.

Quando per il concorso di più fattori viene superata una soglia di sicurezza, la cellula degenera.Per stabilire se una particolare variante della sequenza del DNA è in relazione causale con una malattia, si determina la sua frequenza in un gruppo di pazienti e poi la si confronta con un gruppo di controlli sani.

I calcoli statistici ci diranno se quella associazione è frutto del caso o ha una rilevanza sul piano patogenetico.

Gran parte degli studi sulla SLA si sono indirizzati, in questi anni, verso della ricerca dei fattori genetici predisponenti, ma i risultati sono stati fino ad ora poco significativi. Vi sono due metodologie differenti per la ricerca delle varianti geniche predisponenti le malattie complesse.

Quella più utilizzata è detta Genome Wide Association Studies

(analisi di associazione dell’intero genoma).

E’ noto che il genoma non è identico negli individui appartenenti alla specie umana, cioè la sequenza dei 3 miliardi di basi che costituiscono il DNA differisce in almeno due milioni di basi, senza che questo comporti patologie né necessariamente predisposizione ad esse.

Queste variazioni “normali”, chiamate polimorfismi comuni, sono presenti in almeno 1% della popolazione e sono in gran parte note.

Secondo la metodica del GWA, si esamina un numero altissimo di tali polimorfismi noti (circa 300.000) distribuiti su tutto il genoma e si studia la loro frequenza in un gruppo di pazienti ed in quello di controllo.

Il secondo metodo si basa sulla constatazione che le sequenze del DNA degli individui divergono non solo per cambi di basi azotate “comuni”, cioè presenti in almeno l’1% della popolazione normale, ma anche per sostituzioni di basi che sono “rare”, perchè si ritrovano in percentuali comprese tra lo 0.1 e 1% della popolazione.

Secondo molti scienziati è assai più verosimile che la predisposizione genetica alle malattie complesse sia riconducibile alla presenza delle varianti “rare” e non a quella delle varianti “comuni”.

Per studiare le varianti rare non si possono usare i metodi che analizzano l’intero genoma, come nel GWA, ma bisogna individuare dei “geni candidati” e se ne esamina la sequenza del DNA.

I singoli geni si scelgono sulla base di una ipotesi a priori di un loro possibile ruolo nella funzione e sopravvivenza delle cellule che ci interessa studiare.

La gran parte degli studi di genetica sulla SLA sporadica degli ultimi anni si sono basati sulla metodica del GWAS. Proprio negli ultimi mesi due studi, cui hanno collaborato ricercatori italiani, hanno condotto alla individuazione di geni “sospetti” di avere un ruolo nel causare o rallentare la SLA, ma la reale portata di questi risultati appare poco significativa.

Nel nostro studio abbiamo utilizzato invece la metodica della ricerca di varianti rare (mutazioni) nel gene candidato.

Il nostro studio è stato pubblicato sulla rivista “Human Molecular Genetics il giorno 23 luglio 2009.Abbiamo studiato un gruppo di tre geni che codificano una proteina complessa delle cellule nervose chiamata Recettore Neuronale per l’Acetilcolina.L’ipotesi a priori di un possibile ruolo di questi recettori nella causa della SLA e che ha portato alla scelta di questi geni si fonda sulla dimostrazione che il recettore per l’acetilcolina svolge un ruolo assai importante nel controllo della sopravvivenza delle cellule nervose ed in particolare dei motoneuroni. Inoltre questo recettore regola la capacità dei neuroni di rilasciare il glutammato, una sostanza il cui accumulo si pensa abbia un ruolo nella SLA.

I tre geni, che codificano tre parti diverse del recettore, sono stati sequenziati in 245 persone affette da SLA ed i risultati sono stati confrontati con 450 controlli sani.
Nei tre geni abbiamo trovato che le mutazioni (cioè la sostituzione di una base azotata con un’altra che comporta una modifica nella struttura del recettore) erano presenti nel 6% dei pazienti, mentre solo nell’1% dei controlli.

Da punto di vista statistico questa differenza è molto significativa, cioè la probabilità che questa maggiore frequenza di mutazioni nei pazienti sia un semplice effetto del caso e non abbia un reale significato biologico è solo di 1/1000.
Abbiamo costruito in laboratorio il recettore con le mutazioni trovate nei pazienti e abbiamo studiato se cambiava la sua funzione.

I recettori neuronali per l’acetilcolina sono localizzati nella membrana delle cellule nervose dove funzionano come una finestra: si aprono e si chiudono secondo tempi rigidamente stabiliti quando vengono a contatto con sostanze chimiche come l’acetilcolina o la nicotina e fanno entrare nelle cellule ioni calcio.

Come per il buon controllo dell’ambiente di una casa è fondamentale che le finestre siano aperte o chiuse secondo le necessità, anche il benessere delle cellule e strettamente dipendente dal buon funzionamento dei recettori per l’acetilcolina.

Lo studio in laboratorio ha dimostrato che la quasi totalità delle mutazioni genetiche del recettore osservate nei pazienti determina un’anomalia di funzione: i tempi di apertura della “finestra” sono nettamente superiori rispetto al recettore “normale” e fanno entrare più ioni calcio nelle cellule.

Questo dato è di grande importanza perché, sulla base di altre ricerche, si pensa che un eccesso di calcio nelle cellule sia il meccanismo responsabile del processo degenerativo nella SLA.In conclusione il nostro studio:
dimostra inequivocabilmente che i difetti (mutazioni) nei geni del recettore per l’acetilcolina sono più numerosi nelle persone con SLA;
evidenzia che tali le mutazioni alterano il funzionamento del recettore provocando un aumento degli ioni calcio all’interno delle cellule.

Si tratta di una novità assoluta, la prima volta che si dimostra un possibile meccanismo di danno cellulare nella malattia;
tale meccanismo è plausibile perché vi sono numerosi studi che dimostrano che un eccesso di calcio nelle cellule nervose è responsabile di processi di degenerazione;
fornisce un modello reale (fino ad oggi solo teorico) di interazione tra fattori genetici predisponenti ed ambiente nella SLA. I recettori dell’acetilcolina possono essere, infatti, bersaglio di numerose sostanze ambientali, come nicotina, pesticidi e tossine batteriche, già considerati in passato fattori di rischio per questa malattia;
apre prospettive terapeutiche su basi razionali, essendo stato individuato uno dei meccanismi che provocano la malattia. Tutto ciò richiederà tempo e risorse economiche consistenti.Prospettive future.Tra i 23 ricercatori che hanno contribuito a questa ricerca vi è la consapevolezza di aver provocato una breccia in quella che fino ad oggi appariva una fortezza inaccessibile. Non sappiamo se questa breccia ci porterà in un vicolo cieco o ci permetterà di arrivare alle strutture portanti di questa costruzione mostruosa per minarne le fondamenta. Chiediamo di intensificare gli sforzi. La SLA produce effetti devastanti e per combatterla dobbiamo opporre un forza di pari entità. La nostra esperienza ha sicuramente dimostrato che l’iniziativa di alcune persone, sia nel campo scientifico che nella ricerca di risorse economiche, può dare risultati.