mercoledì 5 novembre 2008



Nuovo studio dell'Università La Sapienza

sugli effetti tossici del gene mutato SOD1


“Cell Metabolism”. (AGI)


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3 commenti:

Fabio & Fabrizio ha detto...

Nuovo studio dell'Università La Sapienza sugli effetti tossici del gene mutato SOD1

(AGI) Un recente studio sperimentale, coordinato da Antonio Musaro’, del dipartimento di Istologia ed embriologia medica della Sapienza, offre nuove speranze nella lotta alla SLA, la sclerosi laterale amiotrofica che colpisce progressivamente i motoneuroni, le cellule nervose che controllano il movimento dei muscoli. A
oggi l’ipotesi piu’ accreditata sulla causa della degenerazione dei motoneuroni e’ la mutazione del gene che produce la superossido dismutasi (enzima SOD1), un potente antiossidante che pulisce le cellule dai radicali liberi. Ma quando l’enzima subisce una mutazione, diventa tossico e provoca la degenerazione delle cellule. Recenti studi sperimentali hanno avanzato il dubbio che i motoneuroni non siano i soli bersagli primari della mutazione SOD1, suggerendo che gli scarsi risultati ottenuti con la terapia convenzionale (Riluzolo) dipendano da una incompleta conoscenza delle basi molecolari e cellulari della malattia stessa. Il progetto di ricerca della Sapienza, finanziato da Telethon (Italia) e dalla Mda-Muscular dystrophy association (USA), ha puntato a dimostrare l’ipotesi che il muscolo scheletrico sia un bersaglio primario dell’effetto tossico del gene mutato SOD1, a prescindere dalla degenerazione dei motoneuroni. La sperimentazione e’ stata condotta nei laboratori del dipartimento di Istologia ed embriologia medica dove i ricercatori hanno generato un topo modificato nel quale gli effetti del gene mutato si producono solo nei confronti dei muscoli volontari. Nella cavia si e’ osservata la progressiva atrofia dei muscoli e la successiva comparsa degli altri sintomi della malattia, senza una apparente degenerazione dei motoneuroni, contrariamente all’ipotesi dominante che li vuole bersaglio primario della SLA. Lo studio e’ stato pubblicato sul numero di novembre della prestigiosa rivista scientifica “Cell Metabolism”. (AGI)

Leggi l'abstract dello studio in lingua inglese qui:

Article
Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity

Gabriella Dobrowolny1, Michela Aucello1, Emanuele Rizzuto1, Sara Beccafico2, Cristina Mammucari3, Simona Bonconpagni2, Silvia Belia3, Francesca Wannenes4, Carmine Nicoletti1, Zaccaria Del Prete5, Nadia Rosenthal6, Mario Molinaro1, Feliciano Protasi2, Giorgio Fanò2, Marco Sandri7, 8, 9 and Antonio Musarò1, 10, ,

1Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, Department of Histology and Medical Embryology, CE-BEMM and IIM, Sapienza University of Rome,Via A. Scarpa, 14 Rome 00161, Italy 2Ce.S.I. Centro Scienze dell'Invecchiamento, IIM, Università degli Studi G. d'Annunzio, Chieti 66100, Italy 3Laboratorio Interuniversitario di Miologia, Università di Perugia, 06100 Italy 4Department of Sciences of Human Movement and Sport, IUSM and INMM-CNR, Rome 00100, Italy 5Department of Mechanical Engineering, Sapienza University of Rome, Rome 00184, Italy 6EMBL Mouse Biology Program, Monterotondo 00016, Italy 7Dulbecco Telethon Institute, University of Padova, Padova 35100, Italy 8Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova 35100, Italy 9Department of Biomedical Science, Padova 35100, Italy 10Edith Cowan University, Perth, Western Australia 6027, Australia

Received 16 May 2008; revised 4 August 2008; accepted 9 September 2008. Published: November 4, 2008. Available online 4 November 2008.




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Summary
The antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1) is a critical player of the antioxidative defense whose activity is altered in several chronic diseases, including amyotrophic lateral sclerosis. However, how oxidative insult affects muscle homeostasis remains unclear. This study addresses the role of oxidative stress on muscle homeostasis and function by the generation of a transgenic mouse model expressing a mutant SOD1 gene (SOD1G93A) selectively in skeletal muscle. Transgenic mice developed progressive muscle atrophy, associated with a significant reduction in muscle strength, alterations in the contractile apparatus, and mitochondrial dysfunction. The analysis of molecular pathways associated with muscle atrophy revealed that accumulation of oxidative stress served as signaling molecules to initiate autophagy, one of the major intracellular degradation mechanisms. These data demonstrate that skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A -mediated toxicity and disclose the molecular mechanism whereby oxidative stress triggers muscle atrophy.

Author Keywords: HUMDISEASE; MOLNEURO

Article Outline
Introduction
Results
Selective Expression of Mutant SOD1G93A Gene in Skeletal Muscle
Muscle-Restricted Expression of SOD1G93A Protein Causes Muscle Atrophy
Mutant SOD1 Alters the Functional Performance and the Contractile and Metabolic Machinery of Skeletal Muscle
Local Expression of SOD1G93A Gene Induces Sarcolemma Damage
Muscle-Specific Expression of SOD1G93A Mutant Gene Modulates Antioxidant Enzyme Activity
Characterization of Molecular Pathways Involved in Oxidative Stress-Induced Muscle Atrophy
ROS Accumulation in Skeletal Muscle Inducing Microglia Activation without Motor Neuron Degeneration
Discussion
Experimental Procedures
Generation of MLC/SOD1G93A Transgenic Mice
RNA Preparation and Northern Blot Analysis
Protein Extraction and Western Blot Analysis
Histological and Immunofluorescence Analysis
Morphometric Analysis and Statistics
Analysis of Oxidative Stress
Antioxidant Enzymes Activities
Trolox Treatment
Mechanical Measurements
RNAi and Adult Mouse Skeletal Muscle Transfection
Electron Microscopy
RNA Extraction and Quantitative RT-PCR
Sequences of Primers Used in Quantitative Real-Time PCR
Statistical Analysis
Acknowledgements
References





Figure 1. Characterization of MLC/SOD1G93A Transgenic Mice

(A) Schematic representation of MLC/SOD1G93A construct.

(B) Western blot analysis for human SOD1 protein in different tissues of both WT (−) and MLC/SOD1G93A trangenic (+) mice.

(C) Northern blot analysis of total RNA samples (15 μg) from heart, brain, liver, spleen, and different skeletal muscles of both wild-type (WT) and transgenic mice was carried out with PolyA SV40 32P-labeled probe. Ethidium bromide staining was used to verify equal loading of the RNA. MLC/SOD1G93A protein (B) and transcripts (C) are restricted to the fastest muscle types in transgenic mice and are undetectable in WT muscles.

(D) Western blot analysis for human SOD1 protein in TA, EDL, and soleus muscle of SOD1G93A and MLC/SOD1G93A mice.


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Fabio & Fabrizio ha detto...

CHE COSA E' LA SOD1:

L'enzima superossido dismutasi (SOD), che appartiene alla classe delle ossidoreduttasi, catalizza la seguente reazione:

2 O2.- + 2 H+ ⇌ O2 + H2O2

Si tratta quindi di un importante antiossidante in quasi tutte le cellule esposte all'ossigeno. Una delle estremamente rare eccezioni è costituita dal Lactobacillus plantarum e relativi lactobacilli, che usano un meccanismo diverso.

Indice [nascondi]
1 Reazione
2 Tipi
2.1 Generale
2.2 Umana
3 Biochimica
4 Fisiologia
5 Usi cosmetici
6 Note
7 Voci correlate
8 Bibliografia
9 Collegamenti esterni



Reazione [modifica]
La dismutazione catalizzata dalla SOD può essere scritta con le seguenti semi-reazioni:

M(n+1)+ − SOD + O2− → Mn+ − SOD + O2
Mn+ − SOD + O2− + 2H+ → M(n+1)+ − SOD + H2O2.
dove M = Cu (n=1) ; Mn (n=2) ; Fe (n=2) ; Ni (n=2).


In questa reazione lo stato di ossidazione del catione metallico oscilla tra n e n+1.


Tipi [modifica]

Generale [modifica]

Struttura del sito attivo della superossido dismutasi 2 umanaEsistono molte forme comuni di SOD: sono proteine cofattorate con rame e zinco, o manganese, ferro, o nichel.

I citosol di praticamente tutte le cellule eucariote contengono enzima SOD conrame e zinco (Cu-Zn-SOD). (Per esempio, Cu-Zn-SOD disponibile in commercio è normalmente purificata dagli eritrociti bovini: PDB 1SXA, EC 1.15.1.1). L'enzima Cu-Zn è un omodimero di peso molecolare 32,500. Le due subunità sono unite innanzitutto grazie a interazioni idrofobiche ed elettrostatiche. I legami di rame e zinco sono catene laterali all'istidina.
I mitocondri del fegato dei polli (e quasi tutti gli altri), e molti batteri (come l' E. coli) contengono una forma con manganese (Mn-SOD). (Per esempio, la Mn-SOD trovata in un mitocondrio umano: PDB 1N0J, EC 1.15.1.1). I legami degli ioni manganese sono 3 catene laterali all'istidina, una catena laterale all'aspartato e una molecola d'acqua o legame o legame ossidrile a seconda dello stato di ossidazione del Mn (rispettivamete II e III). * E. coli e molti altri batteri contengono anche una forma dell'enzima con ferro (Fe-SOD); alcuni batteri contengono Fe-SOD, altri Mn-SOD, e altri entrambi. (Per l'E. coli Fe-SOD: PDB 1ISA, EC 1.15.1.1). I siti attivi delle superossido dismutasi contenenti Mn e Fe contengono lo stesso tipo di amminoacidi nelle catene laterali.

Umana [modifica]
Nell'uomo, sono presenti tre forme di superossido dismutasi. La SOD1 si trova nel citoplasma, la SOD2 nei mitocondri mentre la SOD3 è extracellulare. La prima è un dimero (consiste di due unità), mentre le altre sono tetrameri (quattro subunità). La SOD1 e la SOD3 contengono rame e zinco, mentre la SOD2 ha la manganese nel suo centro di reazione. I geni sono collocati nei cromosomi 21, 6 e 4, rispettivamente (21q22.1, 6q25.3 and 4p15.3-p15.1).





Biochimica [modifica]
L'anione superossido radicale (O2-) dismuta spontaneamente in O2 e H2O2 abbastanza rapidamente (~105 M-1 s-1 a pH 7). Ciononostante, il superossido reagisce ancora più rapidamente in presenza di gruppi come il monossido di azoto, che può formare perossinitrito. Comunque, la SOD ha il più rapido numero di turnover (velocità di reazione con il suo substrato) di ogni altro enzima conosciuto (~109 M-1 s-1), essendo la reazione limitata solo dalla frequenza di collisione tra la stessa e il superossido. Così la SOD catalizza rezioni pericolose del superossido proteggendo la cellula dalla tossicità del superossido.


Fisiologia [modifica]
Il superossido è uno dei maggiori agenti ossidanti nella cellula e di conseguenza, la SOD ha un ruolo antiossidante chiave. L'importanza fisiologica delle SOD è visualizzabile dalle gravi patologie evidenti nei topi modificati geneticamente per mancare di questi enzimi. I topi mancanti della SOD2 muoiono pochi giorni dopo la nascita, a causa del forte stress ossidativo.[1] Quelli cui manca la SOD1 sviluppano una gran varietà di patologie, tra cui il carcinoma epatocellulare[2], un'accelerazione della perdita di massa muscolare legata all'età [3], un'incidenza precoce della cataratta ed una speranza di vita minore. Quelli che mancano della SOD3 non mostrano nessun difetto evidente ed hanno una normale aspettativa di vita[4].

Mutazioni nel primo enzima SOD (SOD1) sono state collegate alla Sclerosi laterale amiotrofica familiare (ALS, una forma di malattia dei motoneuroni). Gli altri due tipo non sono stati collegati ad alcuna malattia umana; comunque nel topo l'inattivazione di SOD2 è causa di mortalità prenatale[5] e l'inattivazione di SOD1 provoca epatocarcinoma[6]. Mutazioni di SOD1 possono causare ALS familiare tramite un meccanismo che al momento ancora non si conosce, ma che non è dovuto alla perdita dell'attività enzimatica.


Usi cosmetici [modifica]
La SOD viene usata nei prodotti cosmetici per ridurre il danno da radicali liberi sulla pelle, per esempio per ridurre una fibrosi dovuta alle radiazioni in caso di cancro al seno. Gli studi sul suo impiego cosmetico devono essere comunque giudicati come tentativi, poiché non ci sono stati controlli adeguati durante lo svolgimento, compresa una mancanza di randomizzazione, del doppio cieco o del placebo. [7]


Note [modifica]
^ Li, et al., Y. (1995). Dilated cardiomyopathy and neonatal lethality in mutant mice lacking manganese superoxide dismutase.. Nat. Genet. 11: 376-381.
^ Elchuri, et al., S. (2005). CuZnSOD deficiency leads to persistent and widespread oxidative damage and hepatocarcinogenesis later in life.. Oncogene 24: 367-380.
^ Muller, et al., F. L. (2006). Absence of CuZn superoxide dismutase leads to elevated oxidative stress and acceleration of age-dependent skeletal muscle atrophy.. Free Radic. Biol. Med 40: 1993-2004.
^ Sentman, et al., M. L. (2006). Phenotypes of mice lacking extracellular superoxide dismutase and copper- and zinc-containing superoxide dismutase. J. Biol. Chem. 281: 6904-6909.
^ Li, et al., Y. (1995). Dilated cardiomyopathy and neonatal lethality in mutant mice lacking manganese superoxide dismutase.. Nat. Genet. 11: 376-381.
^ Elchuri, et al., S. (2005). CuZnSOD deficiency leads to persistent and widespread oxidative damage and hepatocarcinogenesis later in life.. Oncogene 24: 367-380.
^ Campana, F. (2004). Topical superoxide dismutase reduces post-irradiation breast cancer fibrosis. J. Cell. Mol. Med. 8 (1): 109–116.

Voci correlate [modifica]
Catalasi

Bibliografia [modifica]
Keele, B.B., McCord, J.M. and Fridovich, I. Further characterization of bovine superoxide dismutase and its isolation from bovine heart. J. Biol. Chem. 246 (1971) 2875–2880. Entrez PubMed 4324341
Sawada, Y., Ohyama, T. and Yamazaki, I. Preparation and physicochemical properties of green pea superoxide dismutase. Biochim. Biophys. Acta 268 (1972) 305–312. Entrez PubMed 4337330
Vance, P.G., Keele, B.B. and Rajagopalan, K.V. Superoxide dismutase from Streptococcus mutans. Isolation and characterization of two forms of the enzyme. J. Biol. Chem. 247 (1972) 4782–4786. Entrez PubMed 4559499

Collegamenti esterni [modifica]
Il Database Online ALS
Una breve ma sostanziosa panoramica sul SOD e la sua letteratura
Teorie sui danni provocati dall'invecchiamento Include una discussione sul ruolo di SOD1 e SOD2 nell'invecchiamento

Dijo ha detto...

At any rate, I liked some of the vadlo mouse cartoons!